蛔虫卵死亡率的测定

试剂：氢氧化钠、蒸馏水、硝酸钠、甘油、甲醛、甲醛生理盐水。

仪器配件：玻璃珠、振荡器、离心管、离心机、金属丝圈、烧杯、微孔火棉胶滤膜、高尔特曼氏漏斗、弯头镊子、载玻片、显微镜、培养皿、脱脂棉、滤纸、恒温培养箱。

（1）测定方法原理

将碱性溶液与肥料样品充分混合，分离蛔虫卵，然后用密度较蛔虫卵密度大的溶液为漂浮液，使蛔虫卵漂浮在溶液的表面，从而收集检验。

（2）试验方法

①蛔虫卵分离

称取5.0～10.0?g样品（颗粒较大的样品应先进行研磨），放于容量为50?mL离心管中，注入NaOH（氢氧化钠）溶液25～30?mL,另加玻璃珠约10粒，用橡皮塞塞紧管口，放置在振荡器上，静置30?min后，以200～300?r/?min频率振荡10～15?min。振荡完毕，取下离心管上的橡皮塞，用玻璃棒将离心管中的样品充分搅匀，再次用橡皮塞塞紧管口，静置15～30?min 后，振荡10～15?min。

②离心沉淀

从振荡器上取下离心管，拔掉橡皮塞，用滴管吸取蒸馏水，将附着于橡皮塞上和管口内壁的样品冲入管中，以2000～2500?r/?min速度离心3～5?min后，弃去上清液。然后加适量蒸馏水，并用玻璃棒将沉淀物搅起，按上述方法重复洗涤三次。

③离心漂浮

往离心管中加入少量饱和 NaNO3 （硝酸钠）溶液，用玻璃棒将沉淀物搅成糊状后，再徐徐添加饱和 NaNO3 （硝酸钠）溶液，随加随搅，直加到离管口约1?cm为止，用饱和?NaNO3 （硝酸钠）溶液冲洗玻璃棒，洗液并入离心管中，以2000～2500?r/?min速度离心3～5?min。

用金属丝圈不断将离心管表层液膜移于盛有半杯蒸馏水的烧杯中，约30次后，适当增加一些饱和NaNO3 （硝酸钠）溶液于离心管中，再次搅拌、离心及移置液膜，如此反复操作３～４次，直到液膜涂片观察不到蛔虫卵为止。

④抽滤镜检

将烧杯中混合悬液，通过覆以微孔火棉胶滤膜的高尔特曼氏漏斗抽滤。若混合悬液的浑浊度大，可更换滤膜。

抽滤完毕，用弯头镊子将滤膜从漏斗的滤台上小心取下，置于载玻片上，滴加二、三滴甘油溶液，于低倍显微镜下对整张滤膜进行观察和蛔虫卵计数。当观察有蛔虫卵时，将含有蛔虫卵的滤膜进行培养。

⑤培养

在培养皿的底部平铺一层厚约1?cm?的脱脂棉，脱脂棉上铺一张直径与培养皿相适的普通滤纸。为防止霉菌和原生动物的繁殖，可加入甲醛溶液或甲醛生理盐水，以浸透滤纸和脱脂棉为宜。

将含蛔虫卵的滤膜平铺在滤纸上，培养皿加盖后置于恒温培养箱中，在28?℃～30?℃?条件下培养，培养过程中经常滴加蒸馏水或甲醛溶液，使滤膜保持潮湿状态。

⑥镜检

培养10～15?d?，自培养皿中取出滤膜置于载玻片上，滴加甘油溶液，使其透明后，在低倍镜下查找蛔虫卵，然后在高倍镜下根据形态，鉴定卵的死活，并加以计数。镜检时若感觉视野的亮度和膜的透明度不够，可在载玻片上滴一滴蒸馏水，用盖玻片从滤膜上刮下少许含卵滤渣，与水混合均匀，盖上盖玻片进行镜检。

⑦判定

凡含有幼虫的，都认为是活卵，未孵化或单细胞的都判为死卵。

⑧结果计算

K=100(N1-N2)/ N1

式中：

K?—蛔虫卵死亡率（%）

N1—镜检总卵数

N2—培养后镜检活卵数